【知识要点】23中大《生物与医药》考研知识：细菌的转化，复习重点！
细菌的转化转化指宿主细胞直接吸收外源DNA分子(如质粒载体或重组体等等），并获得某些新遗传性状的生命过程。所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。转化现象在原核生物中广泛存在，是自然界中原核生物基因重组的一种主要方式。基因工程中，转化的目的是把具有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞，使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。
1.DNA进入细胞的效率很低，可采取一些方法处理细胞，使细胞容易接受外界DNA，成为感受态细胞，再与外源DNA接触，可提高转化效率。
细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础。基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2处理，成为感受态细菌，加入重组质粒，并由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌。用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法。
2.革兰氏阳性细菌的转化过程分为以下几个阶段：（1）细菌感受态的形成：由于分泌一种称为感受态因子的小蛋白而导致细菌感受态的形成。（2）转化因子的吸收：双链DN**段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。（3）整合复合物前体的形成：一种特殊蛋白与单链DNA结合，有效保护单链DNA免遭核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。（4）单链DNA转化因子的整合：转化DNA单链可以通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区，形成异源杂合双链DNA结构。（5）转化子的形成：受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦半保留复制，当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是新形成一个转化子。
3.影响转化的因素：①DNA能否进入细胞；②DNA进入细胞后的稳定性；③质粒DNA的大小，大质粒的转化效率低于小质粒，到目前，大于30kb的质粒，转化效率仍很低；④DNA的浓度、纯度和形状；⑤诱导感受态细菌所用的离子的种类和浓度；⑥热休克时间的长短及平板培养条件等。
4.Cohen转化法：用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞。①从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。于37℃振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。②在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，冰上放置10～20min；③于4℃4000转/分离心10min，回收细菌细胞；④将管倒置1min，以使最后残留的痕量培养液流尽；⑤以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，4℃4000转/分离心10min，回收细菌细胞；⑥每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用；⑦用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中，加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻旋以混匀内容物，冰浴30min；⑧将离心管放到预加温到42℃的水浴中，90s；⑨将混合物快速转移到冰浴中，冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因；⑩将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上。⑪将平板置于室温至液体被吸收，倒置平板于37℃培养箱中，12～16h，平板培养，克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。l CaCl2能诱导DNA分子对大肠杆菌的转化，可能的原因：1.在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开，诱导大肠杆菌形成感受态。2.Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
5.Hanahan转化法：除了用CaCl2二价离子处理细胞外，还利用二甲基亚砜、二硫苏糖醇和氯化六氨高钴等进一步处理细胞。此法的优点是形成高频率的感受态细胞，转化效率可提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。此法要求条件高，对外界污染物极为敏感。只在极少情况下才用这种方法，如：从较难得到的样品中分离极少量的mRNA，构建cDNA文库时，用此法以获得高的转化率。
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