【知识要点】别错过！23中大《生物与医药》考研知识：聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DN**断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DN**段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。
1. 逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。
2. 竞争逆转录PCR(competitivereversetranscription-polymerasechainrectionC-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。
3. 多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。
4. 反向PCR（iversepolymerasechainreaction）对一个已知的DN**段两侧的未知序列进行扩增和研究。
5. 不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了解目的基因的序列。
6. 锚定PCR（anchoredpolymerasechainreaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。
7. 着色互补试验或荧光PCR（colorcomplementationassayorfluorescentPCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DN**段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。
8.双温PCR（two-temperaturePCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。上述这些PCR技术的应用：①PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针；②通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针；③通过选择性扩增cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；④从微量mRNA中产生cDNA文库；⑤产生大量用于序列分析的DNA；⑥分析基因突变；⑦做染色体步移。
9.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。
而原位PCR（InsituPCR,简称ISPCR），它可使扩增的特定DN**段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。（1）ISPCR的技术特点：①既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；②测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；③有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；④可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。（2）ISPCR的基本方法：IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。（3）初步应用有关原位PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过PCR扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。
有传统的标记探针的原位PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。
原位PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面：（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRN**段、癌基因片段等。
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