【知识要点】23中大《生物与医药》考研知识：基因操作基...
基因操作基本技术及原理—电泳电泳：电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示，泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度。电泳技术以支持物分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。以凝胶形状分为水平平板电泳，园盘柱状电泳及垂直平板电泳。
用支持体的电泳技术：1.纸上电泳。2.醋酸纤维薄膜电泳。3.薄层电泳。4.非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)。5.凝胶支持体区带电泳：①淀粉液②聚丙烯酰胺凝胶③琼脂（糖）凝胶。
不用支持体的电泳技术：1.Tiselius或微量电泳。2.显微电泳。3.等电点聚焦电泳技术。4.等速电泳技术。5.密度梯度电泳。
核酸的凝胶电泳在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收。
01.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定和提纯DN**段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DN**段混合物，分开的DNA可用低浓度的荧光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DN**段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DN**段，以不同速度通过不同浓度的琼脂糖凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DN**段。③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④应用的电压：在低电压时，线状DN**段的迁移率与所用电压成正比。但是电压增高时，大分子量DN**段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DN**段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。
02.聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析和制备小于1Kb长度的DN**段。聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度的凝胶。每100ml上述液体加30μl四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温箱内，以促进聚合。
聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染料的迁移。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。
分子量参照物：为了判断目的DN**段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是HindⅢ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。
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